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EGFR-TKI序贯治疗与hedgehog耐药
时间:2017-05-08   作者:吉三代

目的:这项研究的目的是探讨第一代、第二代和第三代表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂序贯治疗的疗效和在这些抑制剂的连续使用获得性耐药的机制。

体内实验设计:我们开发了一个获得抗表皮生长因子受体抑制剂的治疗裸鼠异种移植HCC827细胞株模型, ,人类非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株存在表皮生长因子受体激活突变,序贯的第一代表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)(埃罗替尼、吉非替尼)的第二代EGFR-TKI(阿法替尼)+ / - anti-EGFR单克隆抗体西妥昔单抗,和第三代EGFR-TKI(奥希替尼)。

结果:HCC827衍生的异种移植和获得性表皮生长因子受体抑制剂耐药对序贯使用第一、第二代和第三代EGFR-TKIs敏感。顺序第一代EGFR抑制剂耐药接着阿法替尼治疗+ / -西妥昔单抗,再次是奥希替尼,在这个模型代表一个有效的治疗策略。而T790M耐药突变没有被检测,获得性耐药的主要机制是Hedgehog (Hh)通路组件的激活。这种现象是伴随着EMT。体外建立细胞系从吉非替尼耐药或afatinib耐药或奥希替尼耐药的肿瘤显示转移特性和保持EGFR-TKIs,选择SMO抑制剂sonidegib抑制Hh联合EGFR-TKI逆转EGFR-TKI耐药,。

结论:EGFR突变NSCLC可以受益于序贯的表皮生长因子受体抑制剂治疗,与耐药机制无关。在复杂和异质的情况下,显示Hh是一个重要的调节抗表皮生长因子受体抑制剂耐药和诱导细胞EMT的因子。

EGFR突变持续EGFR抑制NSCLC的治疗效果。

裸鼠异种移植EGFR 19del HCC827,使用第一代EGFR-TKIs序列(埃罗替尼、吉非替尼)(步骤1),第二代EGFR-TKIs(阿法替尼)+ / -西妥昔单抗,抗EGFR单克隆抗体(步骤2)和第三代EGFR-TKIs(奥希替尼,AZD9291)(步骤3)(图1)。

 

在第一步中, 两组各5只HCC827老鼠使用埃罗替尼/吉非替尼逐步升级的剂量治疗 6个月获得埃罗替尼或吉非替尼耐药的肿瘤细胞。监测肿瘤对治疗的反应,我们使用一个任意分类方法测量体积变化:完全缓解(CR)被定义为没有肿瘤的临床证据在小鼠牺牲后;局部反应(PR)被定义为至少30%肿瘤体积的减少相比基线肿瘤体积,疾病进展(PD)被定义为增加至少20%的肿瘤体积相比基线肿瘤体积;获得性耐药指比肿瘤治疗后最小时增加> 25% 再生长;既不足够减少也不足够增加被视为稳定 (SD)。这一标准的基础上,显示埃罗替尼及吉非替尼治疗HCC827异种移植肿瘤的效果,导致初始剂量依赖性减少肿瘤体积和随后的7/10肿瘤获得性耐药的进展和约60%响应率(RR(有效率),PR和CR),其中包括一个吉非替尼治疗CR反应,持续了6个月,平均响应时间5周.

分析二线治疗最佳治疗选择,在第二步中, 第一代EGFR-TKIs耐药7人每个肿瘤被重新移植到2个新的老鼠和随机阿法替尼升级剂量治疗或西妥昔单抗+阿法替尼,总共14小鼠在步骤2。二线药物治疗开始之前,我们进行了为期一周使用各自的第一代EGFR-TKIs确认持久耐药性。阿法替尼治疗导致PR 5/7,CR 1/7和1/7迅速PD, 阿法替尼+西妥昔单抗治疗CR 4/7,PR4/7,RR为100%。只有一个肿瘤,最初对联合治疗反应灵敏,显示出迅速获得耐药。阿法替尼和阿法替尼+西妥昔单抗CR反应持续了超过6个月。所有5只阿法替尼治疗PR的小鼠经过平均7周的时间后进展。类似于第一步,异种移植的肿瘤样本分析,进行体外培养和重移植。

选择阿法替尼治疗耐药进展可能使用标准化疗或第三代表皮生长因子受体抑制剂。因此,在第三步中,我们决定重新移植5个阿法替尼获得性耐药肿瘤以及一个阿法替尼 +西妥昔单抗联合治疗的获得性耐药肿瘤。每个肿瘤被重新移植2个新的老鼠随机采用常规化疗和剂量逐步升级奥希替尼治疗。类似于前面的步骤,重新移植后进行一周治疗以确认肿瘤阿法替尼或阿法替尼+西妥昔单抗的持续耐药。同样治疗结束后收集异种移植肿瘤样本进行分子分析和建立体外细胞培养。虽然7人没有1人EGFR-TKIs耐药发生T790M突变,奥希替尼治疗带来71%的缓解率RR(包括一个CR维持超过10周,4/7 PR)。获得耐药性的发展发生在治疗的7周内。而化疗引起的1/7PR两周内快速发展的耐药和4/7 SD持续了不到5周。肿瘤耐药前阿法替尼+西妥昔单抗,因此适合重移植进行第三步的实验,这些肿瘤对奥希替尼和化疗完全耐药。

收集每一步EGFR-TKIs耐药肿瘤的DNANGS分析,证明大量驱动突变的代表性细胞系,分别是EGFR (E746_A750delELREA)和KIT(M541L)突变,从平均等位基因频率来看,分别为第一代EGFR-TKIs耐药肿瘤是99%和80%,第二代阿法替尼或阿法替尼+西妥昔单抗是97%和70%,97%和97% ,第三代奥希替尼98%和66%。所有老鼠样本经历获得耐药突变都不存在T790M突变。我们没有检测到新的突变的发生除一个等位基因频率高于2%外,还有一个肿瘤对吉非替尼-阿法替尼-奥希替尼耐药产生 KRAS-G12D突变的等位基因频率检测是8 5%。

第一代、第二代和第三代EGFR抑制剂获得性耐药一个常见信号是Hedgehog通路激活。

免疫印迹分析第一代、第二代和第三代获得性耐药肿瘤蛋白质提取物,显示Hh通路的两个关键组件的水平逐步增加与未经处理的对照的大多数肿瘤样品相比,Smoothened(SMO) 一个7次跨膜蛋白受体,GLI1,主要的转录因子。 EMT激活明显只有在第一代EGFR-TKIs耐药的肿瘤样本,而所有耐药肿瘤显示波形蛋白过度表达表明间充质属性的获得。其他的受体,如AXL,ERBB2,没有显示活性增加。这些结果证实了Hh信号通路是第一代EGFR-TKIs获得性耐药的一个重要调节因子和Hh激活能够持续几代EGFR-TKI治疗。

在几乎所有来自不同的EGFR-TKI耐药的肿瘤蛋白质样本MAPK磷酸化水平很低,除了gefitinib-afatinib-osimertinib耐药发现KRAS-G12D突变。相反,磷酸化AKT蛋白质水平在耐药的肿瘤里升高,表明除非治疗期间出现新突变, 在EGFR-TKI耐药模型存在一个常见的下游信号通路被激活。

为调查Hh和EMT是基因扩增的结果,FISH分析耐药肿瘤样本,检测SMO,EMT。结果是两个基因的基因拷贝数了相似在耐药与未耐药样本。

癌症细胞培养体外研究来自吉非替尼/厄洛替尼-阿法替尼-奥希替尼耐药肿瘤异种移植。研究在是否存在EGFR-TKIs情况下增加Hh通路组件表达的功能性意义,通过调查抑制SMO,使用选择性SMO拮抗剂sonidegib对细胞生存和凋亡的影响。

三个主要的培养样本选择每个步骤耐药的肿瘤(吉非替尼耐药, 阿法替尼耐药, 奥希替尼耐药)。sonidegib(1 mmol/L)没有显著影响肿瘤细胞的生存活性。分别与各代EGFR-TKI联合治疗 sonidegib显著抑制细胞增殖。耐药肿瘤细胞显示波形蛋白的表达增加,表明这些细胞经历了EMT。因此,我们体外评估这些EGFR-TKI耐药细胞在半固体培养基中侵犯,迁移,形成殖民地的能力,。耐药细胞显示高转移性能力没有受到各代EGFR-TKI存在的影响。因此,我们调查了单独或联合EGFR-TKI抑制SMO细胞增殖和转移性属性。例如,EGFR-TKIs耐药细胞迁移能力在各代EGFR-TKI与 sonidegib联合治疗下明显降低,吉非替尼耐药细胞降低12%,和吉非替尼-阿法替尼和吉非替尼-阿法替尼-奥希替尼耐药细胞降低25%。细胞增殖、入侵和不依赖贴壁增长能力也是同样结果。

有趣的是,有两种耐药模型激活特殊的机制。只有一个肿瘤对阿法替尼+西妥昔单抗耐药,然后也对奥希替尼和化疗耐药, 在奥希替尼治疗后显示AXL连同SMO一起激活。在三代EGFR-TKI治疗耐药后PD-L1蛋白质水平逐渐升高。因此,从这个奥希替尼耐药细胞系建立体外肿瘤异种移植用于测试联合抑制AXL,使用foretinib,SMO,使用sonidegib,研究存在与不存在奥希替尼的情况下耐药细胞增殖,迁移和侵犯能力。Foretinib比sonidegib产生更强的细胞增殖抑制,然而sonidegib+Foretinib+奥希替尼显著抑制癌细胞的生长能力。

另一个特定的情况是由吉非替尼-阿法替尼-奥希替尼治疗获得性耐药出现KRAS-G12D突变。对这个肿瘤蛋白质分析显示下游通路增加MAPK磷酸化。因为这个原因我们也决定测试MEK抑制剂司美替尼(AZD6244)活性,单独或联合司美替尼治疗。而司美替尼单药治疗产生适度抑制细胞增殖,联合司美替尼强烈抑制癌细胞生存。

 

 


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