驱动基因的检测是晚期肿瘤患者靶向药物选择的基础，肿瘤组织是靶基因检测的理想标本。获取组织标本的常见方式包括内镜活检、淋巴结活检、手术切除等。多数晚期患者往往难以接受有创检查，临床很难获得或难以获得足够量的肿瘤组织用于基因检测。循环肿瘤DNA(ctDNA)作为组织学基因检测的补充，在指导靶向用药方面具有潜在价值，并在肿瘤的早期诊断、预后判断、残留与复发监测和治疗反应监测等方面也具有潜在的应用价值。

　　1ctDNA检测方法和原理

　　生理或病理状态下，细胞坏死或凋亡时细胞核内或线粒体内DNA会释放到血液、胸腔积液、脑脊液、尿液、痰液或粪便中。细胞外游离DNA(cfDNA)是细胞DNA降解产物，片段大小约150～200 bp。ctDNA作为cfDNA的一类，来源于肿瘤细胞，可反映肿瘤的异质性。血液中ctDNA半衰期为15 min至数小时。人cfDNA浓度多低于100μg/L，平均约30μg/L;中晚期肿瘤患者cfDNA浓度可高达1 000μg/L，平均约180μg/L。cfDNA中ctDNA占比较低。研究发现，中晚期肿瘤患者ctDNA占cfDNA的比例约为8%～10%，在肿瘤早期或治疗缓解后可低至0.01%～1.7%。ctDNA检测的主流方法有突变扩增阻滞系统(ARMS)、数字PCR(dPCR)、新一代测序(NGS)等，各方法检测原理和灵敏度不同。低丰度ctDNA对检测技术的灵敏度要求很高。上述基于PCR技术的ctDNA检测方法要求加入的cfDNA起始量为30～80 ng，各方法的灵敏度、特异性和通量各不相同。对于ARMS和dPCR，不同试剂盒间的检测差异与ctDNA提取率、引物位置、探针修饰有关。对于基于PCR反应的NGS，其检测灵敏度除与样本处理有关外，还与每一步反应效率和测序深度有关。

　　1.1 ARMS

　　ARMS技术利用探针或染料在实时荧光PCR平台上实现对特异引物扩增突变序列的检测。探针法较染料法特异性好、应用广。ARMS检测特异性取决于引物特异性，1个反应中加入多个特异引物，可实现多重扩增，检测同一基因的多个突变。Liu等用人EGFR基因突变检测试剂盒检测86例ⅢB-Ⅳ期非小细胞肺癌(NSCLC)患者组织和血浆EGFR突变，阳性率分别为46.5%(40/86)和31.4%(27/86);40例组织EGFR突变型患者中，27例患者血浆中检测到EGFR突变，敏感性为67.5%;27例组织EGFR野生型患者血浆均未检测到EGFR突变，特异性为100%;该试剂盒检测血浆EGFR基因突变的敏感性较低，但特异性和阳性预测值高。有研究显示治疗前组织EGFR突变丰度低于1%的患者较高于1%的患者使用表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)后的中位无进展生存时间(PFS)和总生存时间(OS)更短。而治疗前血浆中EGFR突变丰度低于0.04%的患者较高于0.04%的患者使用EGFR-TKI后的中位PFS更短。商品化ARMS试剂盒定性检测EGFR的灵敏度为0.5%～1%，可用于组织EGFR检测，但用于血浆EGFR检测时需慎重。血浆EGFR突变丰度与患者预后的关系还有待进一步研究，而选择高灵敏度ctDNA检测技术是开展这项研究的关键因素之一。

　　1.2 dPCR

　　dPCR是一种核酸分子绝对定量技术，分为DNA单分子化、PCR扩增和荧光信号分析3部分。与ARMS检测存在大量cfDNA背景干扰不同，在dPCR扩增前样品被平均分配到几至几百万个单元中。由于每个单元中靶基因以单分子状态呈现，背景干扰少，解决了突变与野生DNA分子基础拷贝数不同而导致二者PCR扩增效率差异大的缺陷。dPCR以反应达到终点时每个反应单元是否具有荧光信号判定反应的阴阳性，根据泊松分布计算原始样本突变基因的拷贝数，实现核酸的绝对定量。探针特异的dPCR检出基因突变的灵敏度可高达0.005%～0.01%，高于特异引物扩增的ARMS分析法。dPCR灵敏度除与检测器的灵敏度和PCR扩增效率等因素有关外，还取决于样本总量和可用于反应的单元总数。样本量足够时，可用于反应的单元总数越多，检测的灵敏度越高，准确度也越高。dPCR适用于拷贝数变异及突变的检测、二代测序结果及等位基因频率的验证等。

　　根据反应单元形成的方式不同，dPCR主要有微滴和微流控芯片2类。微滴数字PCR(ddPCR)源于乳液PCR技术。ddPCR是在传统PCR扩增前将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的油包水微滴，对每个微滴同时进行PCR扩增，扩增结束后，依次采集每个微滴中的荧光信号。一个微滴发生卡可一次检测8个样本。微流控芯片技术是一种基于超高密度亲疏水微孔芯片的dPCR平台。该平台采用包含20 000个微孔的超高密度芯片作为反应载体。每张芯片只能检测一个样品。

　　一项前瞻性研究采用ddPCR分析了29例早期乳腺癌患者肿瘤组织和ctDNA中PIK3CA突变，在15例肿瘤组织中检测到PIK3CA突变的患者中，有14例患者外周血中检测到PIK3CA突变，14例肿瘤组织阴性患者均未在ctDNA中检测到PIK3CA突变(敏感性为93.3%，特异性为100%)。但dPCR一次只可检测一个已知突变。若需要检测靶基因的多个敏感突变位点，则需行多次dPCR。例如，需要检测肺癌患者血浆EGFR基因L858R、E746_A750del、G719X和T790M 4个位点时，则需进行4次dPCR反应，操作繁琐耗时。

　　1.3 SBE结合MALDI-TOF-MS

　　该技术首先通过多重PCR同时扩增多个待测基因突变和野生目的片段，然后加入虾碱酶水解PCR体系中剩余的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)和针对待测基因的引物。其后，在反应系统内加入单碱基延伸引物，该引物的3'末端碱基与待检突变位点的前一个碱基互补。采用4种双脱氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)替代dNTP参加反应。由于ddNTP在脱氧核糖的3'位置缺少一个羟基，故不能同后续的ddNTP形成磷酸二酯键。探针在突变位点处仅延伸一个碱基，且连接上的ddNTP与突变位点的碱基互补。经树脂纯化后的延伸产物和非延伸引物与芯片基质共结晶，用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜。基质从激光中吸收能量传递给核酸分子，核酸分子解吸附并转变为离子。产物离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而测定离子的质荷比(m/z)，从而确定该位点的碱基。

　　Margulies等收集122例Ⅲ～Ⅳ期黑色素瘤患者石蜡包埋组织和配对血浆，采用ARMS法检测肿瘤组织中BRAF V600E突变;与组织检测结果相比，质谱法和ARMS法检测ctDNA的阳性一致率分别为76.4%(55/72)和54.2%(39/72)，阴性一致率分别为98%(49/50)和96%(48/50)。单碱基延伸技术(SBE)结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)可同时检测同一基因或多个不同基因已知的热点突变，检测通量较大，操作时间短，成本低，也可定量检测突变丰度。突变基因质谱法检测的灵敏度约为1%，并且由于多重PCR的循环数较多(约40个循环)，突变DNA分子和野生DNA分子可能存在非等倍扩增现象，导致质谱法检测到的突变丰度与实际丰度存在一定偏差。

　　1.4 NGS

　　NGS可实现对多基因核酸片段进行高通量平行深度测序，定量检测突变丰度，发现未知突变。cfDNA加入量足够时，NGS的灵敏度(0.02%～5%)取决于测序深度。

　　2ctDNA检测在恶性肿瘤中的应用

　　2.1 早期诊断

　　早期肿瘤患者cfDNA含量低，ctDNA丰度低，对检测灵敏度要求高。虽然ctDNA在肿瘤早期筛查中的价值并未被看好，但其仍然受到关注。2014年，Newman等从肿瘤基因图谱库407位NSCLC患者全基因组测序结果和肿瘤基因突变数据库筛选139个基因设计成NGS检测组合，该组合基因突变在肺腺癌或鳞癌患者中发生率为96%。研究者将这种方法命名为癌症个体化深度测序分析方法(CAPP-Seq)。与组织结果相比，CAPP-Seq在Ⅰ期(4例)和Ⅱ～Ⅳ期(9例)NSCLC中检出基因突变的敏感性分别为50%和100%，在各期NSCLC中特异性为96%。ctDNA用于肿瘤早期诊断，除需高灵敏度的技术，还需设定合适的基因组合。由于不同种类的肿瘤突变谱不同，设定的基因组合最好能覆盖不同肿瘤80%～90%突变。

　　2.2 微小残留病灶和复发监测

　　液体活检，包括ctDNA和循环肿瘤细胞(CTC)，在微小残留病灶和复发监测中的应用研究成为近2年来的热点，在微小残留病灶检测和复发预警中具有潜在应用价值。ctDNA对于微小残留病灶评估和复发监测研究多集中于直结肠癌和胰腺癌。Tie等对178例术后未接受辅助化疗的Ⅱ期结肠癌患者进行为期4年的追踪试验。研究者采用NGS监测血浆体细胞突变。患者于术后每6个月接受一次全身CT扫描，4～10周内、10周后每3个月分别采集新鲜外周血。采用NGS对连续收集的外周血浆行6个基因外显子突变检测，术后ctDNA阳性和阴性患者例数分别为14和164，复发率分别为78.6%(11/14)和9.8%(16/164)，无复发生存时间分别为7.9和27个月;提示ctDNA检测或可作为病灶是否完全清除的指标，对部分早期结肠癌患者肿瘤复发风险具有预测作用。Reinert等还比较了影像学、癌胚抗原(CEA)、ctDNA监测结直肠癌术后早期复发的性能，发现ctDNA较CEA升高和影像学发现改变早10个月。微小残留病灶和复发的早期发现对于复发的早期干预和延长患者生存时间非常重要。早期肿瘤患者血清蛋白质类肿瘤标志物阳性率低，对于微小残留检测价值有限。肿瘤患者术后复发监测主要靠影像学和蛋白质类肿瘤标志物，但前者不能及时反映患者病情的进展，后者敏感性低。ctDNA在监测结直肠癌和胰腺癌患者术后微小残留病灶和复发方面具有一定价值，但在其他肿瘤中的应用价值以及向临床转化还有待进一步研究。

　　2.3 疗效评价

　　肿瘤疗效评价为基于影像学检查的实体瘤疗效评价标准。血清蛋白质类肿瘤标志物的变化与影像学疗效评价的一致率不超过50%。近2年来，已有ctDNA用于晚期肺癌、结直肠癌治疗的耐药预警，较早的相关研究发表于新英格兰医学杂志。该项研究采用靶向或全基因组测序检测了52例正接受全身性治疗的转移性乳腺癌患者肿瘤基因组改变，采用ddPCR或靶向测序检测组织基因突变阳性患者(以PIK3CA和TP53基因突变居多)血浆中对应基因突变拷贝数改变。研究还检测了相同时间点CA15-3水平和CTC数量。CTC检测采用CellSearch平台。研究验证NGS检测ctDNA突变丰度与ddPCR具有良好的一致性。该研究发现在30例组织中检测到基因突变患者的外周血中ctDNA检出的阳性率为97%，而CTC和CA15-3阳性率分别为87%和78%。与影像学结果相比，无论用NGS或ddPCR检测的ctDNA水平动态改变与肿瘤负荷改变一致性好，且两者的关联性优于CA15-3及CTC。ctDNA可以成批检测，避免影像学检查的长时间等候预约。ctDNA中多个突变基因检测可以反映肿瘤克隆的演变，但向临床转化还需要大规模多中心的前瞻性研究。

　　2.4指导靶向药物使用

　　癌组织基因检测对于指导靶向治疗具有重要意义。2015年2月CFDA批准对吉非替尼说明书的更新，新说明书要求晚期NSCLC患者治疗前应检测组织EGFR突变，但如不可获得或不可获得足够的肿瘤组织时，则可检测血液标本中ctDNA并评估，以鉴别出最可能从吉非替尼治疗中受益的NSCLC患者。2015年，《非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识》也提出当肿瘤组织难以获取时，血液是EGFR基因突变检测合适的替代生物材料，也可作为对可疑组织检测结果的补充。2016年，文献报道采用ddPCR检测73例组织EGFR突变的晚期肺腺癌患者TKI治疗前和治疗后不同时间段血浆中EGFR突变频率，治疗前血浆EGFR突变频率0.04%～5.15%的患者，其PFS显著短于血浆EGFR突变频率＞5.15%的患者(11.1个月vs 15.4个月)，但显著长于血浆EGFR突变频率＜0.04%的患者(11.1个月vs 6.7个月)。该项研究还发现治疗后血浆EGFR丰度下降患者的PFS(12.7个月vs 7.1个月)和OS(总生存时间)(28.3个月vs 14.9个月)均显著长于治疗后未下降者。目前已有部分厂家可检测血浆中的某些融合基因，如ALK、ROS1等，但这些技术之间的阳性一致率、阴性一致率以及检测结果能否指导用药，进一步改善患者转归还未见报道。

　　耐药是靶向治疗的必然结果，耐药突变基因检测有助于耐药的发现和治疗方案的调整。TKI治疗后耐药的晚期NSCLC患者中EGFRT790M突变率约为50%，T790M突变患者被推荐使用AZD9291。2014年，Oxnard等采用dPCR连续监测9例晚期肺癌患者厄洛替尼治疗过程中血浆中EGFRT790M突变，结果6例患者进展，这6例患者的血浆中均检测到T790M突变。该研究显示血浆T790M突变可在影像学发现疾病进展前8～24周被检测到，提示ctDNA动态监测可及时发现T790M耐药基因位点，有助于临床及时更换方案。

　　组织KRAS基因突变检测已被NCCN指南推荐为结直肠癌患者用抗EGFR治疗前的检测项目，KRAS基因突变患者不推荐用西妥昔单抗(抗EGFR)治疗。早在2010年，比利时DeRoock等采用质谱法检测750例接受西妥昔单抗治疗的转移性结直肠癌患者肿瘤组织中KRAS、BRAF、NRAS和PIK3CA基因的突变状态，并分析这些基因的突变状态与患者的治疗反应率、PFS和OS的关系，发现KRAS突变型患者的治疗反应率、中位PFS和中位OS均低于KRAS野生型患者(治疗反应率:6.7%vs 35.8%;中位PFS:12周vs 24周;中位OS:32周vs50周)。目前血浆KRAS基因突变检测用于指导用药还未达成专家共识，但未来或可先通过血浆KRAS基因检测，免除对血浆KRAS基因突变阳性患者的活检。结直肠癌血浆KRAS检测的阳性预测值受到关注。多项研究结果表明血浆KRAS基因检测在中、晚期结直肠癌中具有理想的阳性预测值。术后或不可手术晚期胃肠间质瘤患者组织C-KIT和PDGFR及晚期黑色素瘤患者组织BRAF V600E和C-KIT基因突变应用于前者选择伊马替尼和后者选择威罗替尼。胃肠间质瘤、黑色素瘤血浆基因突变检测也应该具有意义。

　　2.5 生存评估

　　研究显示年龄、性别、病理类型、T分期、N分期、淋巴结采样数量与NSCLC患者术后生存有关，而初始ctDNA定性和定量检测预测肿瘤患者生存的研究少见。Kinugasa等采用ddPCR检测了75例Ⅱ～Ⅳ期(Ⅲ～Ⅳ期患者占97%)胰腺癌患者肿瘤组织和cfDNA中KRAS突变，结果在肿瘤组织和cfDNA中检测到KRAS突变比例分别为74.7%和62.7%。研究发现，组织KRAS基因检测阳性和阴性患者OS差异无统计学意义(351 d vs 301 d)，而ctDNA检测阳性患者OS较阴性患者短(413 d vs 276 d)。Sanmamed等采用ddPCR检测19例组织BRAF V600E突变的晚期黑色素瘤患者治疗前外周血中BRAF V600E的浓度(copies/mL)，结果在16例患者外周血中检测到BRAF V600E突变。研究发现OS超过2年的患者，其初治时血浆BRAF V600E浓度较OS短于2年的患者低(27 copies/mL vs 478 copies/mL)。以216 copies/mL为临界值，ctDNA低于临界值患者的PFS和OS较ctDNA高于临界值的患者长(PFS:9个月vs 3个月;OS:27.7个月vs 8.6个月)。肿瘤患者的生存与肿瘤病理类型、肿瘤分期和负荷、生理状况等诸多因素相关。目前已有研究综合患者的临床资料，包括年龄、性别、吸烟史、病理类型、分期、淋巴结采样数目等构建模型，评估患者预后，但未见结合临床资料和ctDNA浓度及丰度评估预后的模型。该模型的构建或能更好地评估肿瘤患者的预后。

　　3存在的问题与思考

　　不同分析技术平台的涌现实现了ctDNA基因检测从单基因到多基因、定性到定量的发展。ctDNA在实体肿瘤中的应用研究层出不穷，目前只有血浆EGFR检测被推荐作为组织检测的补充，用于指导晚期NSCLC患者的靶向用药。ctDNA检测在早期诊断、微小残留检测和复发监测、治疗效果评价、生存评估中的应用价值仍在研究和验证中。ctDNA检测的临床应用价值已经受到关注，正逐步进入临床应用。不同ctDNA检测平台的分析性能和临床诊断性能的评价、ctDNA的规范检测应该受到关注。以下4个方面值得思考。

　　3.1 ctDNA反映肿瘤异质性的能力

　　肿瘤异质性是基因检测和肿瘤治疗面对的难题。肿瘤异质性主要表现为不同个体之间、不同癌细胞之间、原发灶和转移灶之间、不同转移灶之间的异质性。ctDNA能反映肿瘤异质性是其检测优势。组织中基因突变频率与癌组织占有的比例及突变与未突变的克隆比例有关。研究发现晚期肺癌患者血浆EGFR和晚期结直肠癌患者血浆KRAS检测的敏感性可达60%～80%，说明ctDNA可敏感地检测出大部分晚期肺癌和晚期直结肠癌患者携有该突变的克隆。哪些肿瘤患者血浆ctDNA可作为组织基因检测的替代材料需要深入研究。对于进展期患者，如果转移灶靶基因检测阴性，而血浆检测阳性，可能与取得的活检标本未包括有突变的克隆有关。要验证此假设，需对患者进行多部位活检或尸检，比较活检或尸检组织与ctDNA检测的一致性。类似研究仅有个案报道。

　　3.2 不同平台检测ctDNA基因突变的一致性与假阳性  

　　不同平台检测ctDNA突变结果不一致令临床和患者困惑。检测结果不一致与方法不同、同一方法不同平台的敏感性及特异性、对检出信号阳性阈值的设置不同有关。如前所述，dPCR检测的灵敏度最高，可达0.1%。基于ARMS和NGS的检出灵敏度有的仅达1%，有的可接近0.2%～0.5%。如用于复发监测、靶基因丰度改变的监测、疗效评估、结局预测，则要求该技术的灵敏度达到0.1%，且可定量报告ctDNA丰度和拷贝数。我们的研究初步发现当晚期NSCLC患者血浆EGFR突变丰度＞1%时，ARMS、ddPCR和NGS的阳性一致率、阴性一致率均高于90%，而当突变丰度＜1%时，较低灵敏度的某ARMS产品与较高灵敏度的NGS和ddPCR平台的阳性一致率低于15%。似乎1%的检出敏感性是评价基于PCR检测ctDNA的不同平台检测能力的分水岭。文献和我们的研究均发现EGFRT790M(ACG＞ATG)阳性结果的报告富有挑战性，该位点的C碱基可自发脱氨基生成U，且该点位于CpG岛内，C碱基的甲基化可增加其脱氨基的风险，三联密码子对应的氨基酸由苏氨酸(T)变成甲硫氨酸(M)，从而出现假阳性。有厂家通过提高该位点的判读阈值来降低假阳性率。样本前处理也影响ctDNA检测结果。使用含不同种类细胞保护剂样本采集管和样本采集后放置的时间、cfDNA提取试剂种类都会影响ctDNA检测结果的阴阳性，未见到相关系统研究报告。

　　3.3 优化分子病理检测和液体活检的流程

　　不同平台检测ctDNA的通量不同，价格相差很大。合理和优化使用ctDNA检测以减轻患者负担受到重视。合理应用ctDNA检测的指导意见有待讨论与出版。为此，分子病理检测和液体活检流程的优化被纳入了“重大慢性非传染性疾病防控研究”2017年度重点专项的资助范围。

　　ARMS检测价格适宜，一次可检测单个基因的多个已知突变，操作简单。检测已知的、单个临床上可用药物抑制的靶点(如EGFR、KRAS、BRAF等基因突变)，ctDNA检测推荐ARMS法。dPCR是近年来发展起来的具有高灵敏度的新技术，其一个反应只能定量检测一个已知突变位点，对于多个突变位点的检测，需要更多的样本量，操作繁琐，价格较ARMS贵。目前有许多厂家试图开发dPCR试剂盒。dPCR现多用于临床研究。dPCR检测敏感突变的基线丰度以及治疗过程中ctDNA的丰度消涨对于疗效评价和生存评价具有价值，是一个具有应用潜力的技术。NGS可定量检测多个基因的多个位点。NGS检测ctDNA突变丰度可与dPCR相当。普通和超灵敏的NGS成本高，但最具应用潜力。以EGFR检测为例，由于多数研究发现术后复发患者的EGFR突变状态与患者数年前的组织EGFR检测结果具有良好的一致性，所以当原始组织标本可获得时，采用ARMS检测组织EGFR突变状态用于指导用药可行。需动态监测者可采用dPCR监测血浆EGFR突变以用于疗效评价和预后评估，该模式具有较好的分子检测经济学。普通NGS尚不能完全取代EGFR等突变基因的ARMS检测、ALK和ROS1等融合基因的免疫组化或逆转录PCR检测，但其在肿瘤组织基因突变检测中的应用将越来越广泛。如经济条件允许，可首先直接采用普通NGS检测组织基因突变谱，其后采用dPCR或超灵敏NGS平行定量检测血浆驱动基因以及其他基因突变丰度消涨以预测肿瘤克隆演变。目前血浆中ALK、ROS1等融合基因的NGS检测方法正在开发中。临床医生应该向患者说明不同检测技术的检测性能(包括灵敏度、特异性、假阳性、通量等)及花费，让患者做出适合自身检测的选择。

　　3.4 ctDNA标准品的研制

　　ctDNA检测质控品的研发和室间质量评价计划刚起步。含突变位点的细胞系基因组DNA或重组质粒均可作为ARMS和dPCR检测的质控物。由于ctDNA片段小，制备与ctDNA长度相当、基质与血浆类似的参考物用于NGS的质量控制应该受到关注，此类参考物也适用于ctDNA ARMS和dPCR的质量控制。英国Horizon Discovery公司发布了商品化的ctDNA标准品，该标准品来源于细胞系基因组DNA。近2年来，美国病理学家协会也启动了ctDNA检测的室间质量评价。与人血浆ctDNA性质相似的标准品制备瓶颈包括DNA的片段化和ctDNA突变丰度的定值。片段化DNA包括超声法和酶切法，有学者认为酶切法产生的DNA片段用于建库的效率更高。ctDNA突变丰度的定值较困难。理论上采用具有100%突变频率的细胞系基因组DNA与野生型细胞系勾兑可完成配制。但细胞系的基因组突变与健康人的胚系基因突变不同，纯合型和杂合型突变的频率多不是100%和50%，难以克隆到某基因突变频率为100%的细胞系，即便寻找到或克隆到这类细胞系，传代对突变丰度的影响也不清楚。期待突变丰度赋值准确、基质与血浆类似、内含的DNA建库效率高、片段大小与ctDNA一致、适用于NGS质量控制的参考品问世。

　　海得康发掘国际新药动态，为国内患者提供全球已上市药品的咨询服务，如丙肝新药印度吉三代、肝癌新药印度多吉美、PD-1、PD-L1、肺癌AZD9291等，帮助国内患者选择更新更有效的治疗药物和手段，更多药品信息及购药渠道，详询：400-001-9763,010-67385800，微信：headkonhdk     www.headkonmed.com