HDGF通过激活非小细胞肺癌中的PI3K/AKT和MEK/ERK信号通路促进吉非替尼（Gefitinib）耐药

肺癌是全球癌症相关死亡的最常见原因。非小细胞肺癌(NSCLC)约占所有肺癌病例的80%。表皮生长因子受体(EGFR)突变患者对酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)反应良好，但所有有反应的患者最终对TKIs产生获得性耐药。TKI耐药的潜在机制包括靶基因的继发性耐药突变、旁路信号通路的激活、下游效应子的失调和表型转化[2].EGFR第20外显子的T790M突变约占耐药病例的50%,是TKIs的主要耐药机制。然而，大约19%的耐药机制仍然未知。

肝癌衍生生长因子(HDGF)是一种肝素结合生长因子，最初是从Huh-7肝癌细胞系的条件培养基中鉴定出来的，表示可以分泌。据报道，HDGF与癌细胞生长、血管生成、抗凋亡和肿瘤转移有关。在一系列肿瘤类型中，包括非小细胞肺癌、卵巢癌、口腔癌、胃癌和黑色素瘤，HDGF过表达，其高表达与不良预后密切相关。HDGF增强非小细胞肺癌血管内皮生长因子依赖性血管生成，高血清HDGF水平预示非小细胞肺癌骨转移和不良预后。在手术切除的I期非小细胞肺癌中，HDGF被认为是分子分期和预后的生物标志物，并为术后辅助化疗提供预测。抑制HDGF抑制了体外和体内的肿瘤细胞生长。针对HDGF的抗体可以通过抑制肿瘤干细胞来预防非小细胞肺癌化疗后的复发。一些微小RNA通过靶向HDGF抑制非小细胞肺癌的增殖和侵袭。因此，HDGF是非小细胞肺癌治疗的一个有希望的潜在靶点。

我们之前的实验证明通关藤提取物(MTE)可在体内外克服非小细胞肺癌对吉非替尼(一种广泛使用的第一代TKI)的耐药性。同时，MTE可以通过靶向HDGF干扰肿瘤相关巨噬细胞和非小细胞肺癌细胞之间的相互作用。我们的初步研究表明，MTE联合吉非替尼可以减少耐药H1975细胞中HDGF的表达，这一点由2D凝胶电泳结合高效液相色谱-串联质谱(HPLC/MS/MS)和蛋白质印迹法。研究表明，HDGF促进结肠直肠癌细胞和舌鳞状细胞癌的化疗耐药性，它还会导致乳腺癌的放射抗性。然而，HDGF在吉非替尼耐药中的作用尚不清楚。尽管位点特异性肽报告基因和靶向质谱表明，HDGF-S165，一种合成底物肽，可能与TKI耐药性有潜在关联，没有直接证据表明HDGF水平和TKI疗效相关。在这项研究中，我们在体外和体内证明了HDGF和吉非替尼耐药性之间的相关性，并确定了HDGF和EGFR在NSCLC细胞中的互补作用。

通过2D凝胶和LC MS/MS分析，HDGF被鉴定为用吉非替尼或MTE单独或组合处理的H1975细胞中差异表达的蛋白质之一。研究表明，HDGF表达被视为早期NSCLC患者的预后因素；HDGF还会促进某些肿瘤的化疗耐药性，包括结直肠癌、舌鳞状细胞癌和乳腺癌。因此，我们选择HDGF作为进一步研究的目标蛋白。蛋白质印迹结果显示，在H1975细胞中，与每种单一处理和对照组相比，暴露于吉非替尼和MTE组合处理后，HDGF显著下调。

为了进一步了解HDGF在非小细胞肺癌中的作用，我们检测了其在对吉非替尼有不同反应的七种非小细胞肺癌细胞系中的表达。吉非替尼敏感的PC-9和H292细胞具有相对较低的HDGF表达，而H1975细胞表达非常高水平的HDGF。HDGF在H1975细胞中被CRISPR/Cas9系统敲除，而通过将HDGF plenti6-TR质粒转染到PC-9和H292细胞中建立了稳定的HDGF过表达。通过蛋白质印迹和qRT PCR验证HDGF的过表达或敲低。

了解HDGF在非小细胞肺癌中的作用后，进一步研究了HDGF表达和吉非替尼疗效之间的关系。在H1975细胞中，通过sgRNAs敲低HDGF对吉非替尼反应良好，其IC50值分别为2.21微米和1.08微米，而在sgRNA对照组中为7.30微米。相反，与吉非替尼敏感的亲代H292和PC-9细胞相比，HDGF将吉非替尼的IC50值增加了17倍和20倍。吉非替尼治疗显著抑制了HDGF沉默的H1975细胞中的集落形成、迁移和侵袭能力，但在对照组中仅产生轻微影响。相反，吉非替尼治疗减少了集落形成以及迁移和入侵能力对H292和PC-9细胞的抑制作用，但这些抑制作用在HDGF过表达后消失。上述结果表明，较高的HDGF表达可能与吉非替尼耐药有关。

为了探索HDGF驱动的吉非替尼耐药的机制，我们测定了NSCLC细胞中吉非替尼耐药相关蛋白p-Akt和p-ERK和小鼠肿瘤组织。HDGF敲除显著降低p-Akt和p-ERK的表达，这种作用被吉非替尼进一步加强，吉非替尼单独增加H975细胞中Akt和ERK的磷酸化。相比之下，尽管吉非替尼显著抑制H292和PC-9细胞中的p-Akt和p-ERK，但它不能逆转HDGF过度表达引起的Akt和ERK磷酸化的升级。上述数据进一步支持HDGF水平与吉非替尼耐药相关信号传导相关。

先前的结果表明，HDGF诱导的细胞生长被Akt或ERK途径的抑制剂取消或逆转。5C，我们添加了MK 2206(Akt的抑制剂)或u 0126(ERK的抑制剂)来验证HDGF是否通过这两条信号通路促进吉非替尼耐药。结果显示HDGF处理确实降低了PC-9细胞对吉非替尼的敏感性；然而，HDGF对吉非替尼耐药的增强作用被MK2206或U0126大大减弱，提示HDGF可能通过Akt和ERK信号通路诱导吉非替尼耐药。

EGFR T790M突变是吉非替尼耐药的主要机制。为了探索HDGF是否参与T790M介导的吉非替尼耐药性，将pcDNA3.1-EGFR T790M突变质粒和HDGF过表达载体单独或一起引入PC-9细胞。5D我们的结果显示，T790M突变或HDGF过表达单独导致吉非替尼耐药性，IC50值分别为0.107 M和0.181 M。更重要的是，当PC-9细胞经受T790M突变和HDGF过表达时，吉非替尼耐药性(IC50 = 0.253 M)比具有单一T790M突变或HDGF过表达的细胞进一步增强。这些结果表明，T790M突变或HDGF过表达引起的吉非替尼耐药可能不具有相同的机制。因此，HDGF可能不参与T790M突变引发的吉非替尼耐药。

“海得康”发掘国际新药动态，为国内患者提供全球已上市药品的咨询服务，请咨询海得康医学顾问：400-001-9769，海得康官网微信：15600654560。

　　【友情提示：本文医药信息内容仅供参考，具体疾病治疗和用药请咨询医生评估，海得康不承担任何责任。本站图片来源于网络，侵权请联系删除。】