CAR-T细胞内在PD-1免疫检测点阻滞：一种二合一实体瘤免疫疗法

　　实体瘤上PD-L1/2的表达抑制了CAR-T细胞的功效，CAR-T细胞上PD-1阴性受体的表达提供了细胞内在的免疫检查点阻断作用并增强了抗肿瘤功效。CAR-T细胞与免疫检查点阻断的结合免疫疗法是一种针对实体瘤的有前景的疗法。

　　嵌合抗原受体（CARs）是一种人工合成的受体，它可以重定向T细胞使其识别癌细胞表面抗原来清除癌细胞。CARs是由一段胞外单链抗原可变区片段（scFV）、跨膜区和胞内信号区3个部分组成。第一代的CARs是将scFV区与激活抗原特异性T细胞的CD3ζ胞内信号区连接。之后开发的CARs是包含了额外的共刺激信号（CD28、4-1BB,和OX40（二代CARs包含其中一个，三代包含其中两个））来增强和维持T细胞功效。

　　CAR-T 细胞疗法在实体瘤上的应用需要克服一系列的挑战，包括CAR-T 细胞如何有效运输和渗透到肿瘤组织中以及克服肿瘤介导的免疫抑制。我们发现在胸膜间皮瘤原位模型中扩增间皮瘤特异性CAR-T细胞，单一种类的低剂量CAR-T细胞能有效抑制肿瘤生长并形成长期的免疫。在这个临床相关模型中，我们研究了重复的抗原刺激下T细胞的衰竭情况并进一步探索提高CAR-T细胞功能持久性的策略。试验中我们使用了3种CARs，这三种CARs包含一个抗人的间皮瘤特异性scFV同时包含CD3ζ、CD28/ CD3ζ或者4-1BB/CD3ζ 信号区。我们选择了效靶比为1:7500的一个低剂量的MSLN靶向的CAR-T细胞。尽管与一代CARs相比，二代CAR-T 细胞 (M28z and MBBz)表现出优越的抗肿瘤功效，但用M28z处理的小鼠最后死于肿瘤复发，而MBBz处理的小鼠无肿瘤状态的比例相对更高。在体外刺激下，与肿瘤结合的M28z细胞细胞毒性减弱和Th1细胞因子的产生减少，这与T细胞的衰竭相关。显然，尽管MBBz T细胞与M28z细胞相比细胞功效能保持更久，但整体而言细胞毒性和细胞因子的产生也随着重复的抗原刺激而减少，这表明了MBBz 细胞也很容易出现衰竭，这些结果强调实体瘤免疫抑制微环境的长期抗肿瘤功效需要CAR-T细胞功能的持久性。

　　随着肿瘤细胞上PD-1配体PD-L1和PD-L2的上调表达，CART细胞过表达PD1等抑制受体以做出反应。用PD-1和PD-L1阻断抗体在体外和体内都能明显增强M28z的功效减小肿瘤负荷。然而当停止使用抗体后肿瘤出现复发，而长期使用抗体治疗能控制肿瘤的进一步发展但并没有根除肿瘤细胞。总而言之，我们的观察表明获得性阻力在CART细胞耗竭过程中扮演了重要的角色。PD-1阻断抗体能补救M28z T细胞功能。它的功效是短暂的，需要多次使用抗体来抑制肿瘤的发展。

　　为了使CAR-T细胞不依赖重复抗体作用，我们通过基因工程技术构建了CAR-T细胞过表达PD-1阴性受体（PD-1 DNR）（缺乏PD-1跨膜区和胞内信号区），我们假定PD-1 DNR在CART细胞表面表达作为一个诱骗受体去结合并阻断PD-L1和PD-L2抑制信号。实验结果确实表明与PD-1 DNR共转化的M28z CAR-T细胞在重复抗原刺激下，与单纯的M28z细胞相比其增值、细胞毒性和细胞因子的分泌都有增强。小鼠实验也表明M28z PD-1 DNR能更好控制肿瘤负荷和延长中位生存期。在CART细胞中还有一些其他的方法用来阻断PD-1抑制信号，例如共表达一个含有PD-1胞外区和跨膜区受体、在抗MSLN CART 中包含PD-1 CD28胞内区，或者抗前列腺特异性CART 细胞表达4-1BB共刺激信号区、以及用CRISPR/Cas9基因编辑技术制备PD-1缺陷的抗CD19 CAR-T 细胞

　　在我们的研究中，抗PD-1抗体和PD-1 DNR提高了CART细胞的功效。与CART细胞和抗体联用相比，改造的CAR-T技术存在许多优势，首先阻滞PD-1信号的 CAR-T细胞提供了更持续的功效，其次基因工程 CAR-T只阻断肿瘤细胞上 PD-1抑制，抗PD-1抗体的效率会受到肿瘤渗透性差、半衰期段、非特异性毒性等的限制。然而MSLN靶向CARs通过结合抗体或与PD-1DNR免疫检查点阻断结合的技术给许多实体瘤治疗提供可能。

　　一些小鼠实验使用单一剂量的M28z PD-1 DNR CAR-T细胞出现了肿瘤复发，这表明肿瘤微环境中还有许多免疫抑制情况需要克服。除了PD-1受体外许多共抑制受体如TIM-3、LAG3和 TIGIT等在T细胞上表达，同时，靶向多种抑制通路可以提高CAR-T细胞的功效。对肿瘤浸润性T细胞的抑制机制，内在的和改造的CAR-T细胞机制的理解能帮助我们设计下一代免疫治疗方法。基因工程T细胞提供了设计合理的CAR结构来提高CART细胞疗法的功效，并可能成功治疗实体瘤。